eu ideal

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 9483 (2022) Citar este artigo

7512 Acessos

7 Citações

2 Altmétrica

Detalhes das métricas

As nanopartículas lipídicas (LNPs) para entrega de RNA e DNA atraíram atenção considerável por sua capacidade de tratar uma ampla gama de doenças e de vetorizar mRNA para vacinas COVID. As LNPs são produzidas pela mistura de biomoléculas e lipídios, que se automontam para formar a estrutura desejada. Neste domínio, a microfluídica mostra vantagens claras: alta qualidade de mistura, condições de baixo estresse e preparação rápida. Estudos de LNPs produzidas em micromisturadores revelaram, em certas faixas de vazões, uma degradação no desempenho em termos de tamanho, monodispersão e eficiência de encapsulamento. Neste estudo, nos concentramos no micromixer de anel, que é bem adaptado para alto rendimento. Revelamos três regimes, lado a lado, transicional e altamente mixado, que controlam o desempenho de mixagem do dispositivo. Além disso, usando crio-TEM e análise bioquímica, mostramos que os desempenhos de mistura estão fortemente correlacionados com as características dos LNPs que produzimos. Enfatizamos a importância da razão fluxo-vazão e propomos um critério físico baseado no aparecimento de instabilidades temporais para produzir LNPs com características ótimas em termos de geometria, monodispersão e rendimento de encapsulamento. Esses critérios são geralmente aplicáveis.

Muitos avanços foram feitos na última década. De fato, desde que os primeiros micromisturadores apareceram no início do século, aproximadamente uma centena de dispositivos funcionais baseados em vários conceitos foram desenvolvidos. Todos eles têm vantagens e desvantagens, mas, em geral, os usuários geralmente encontram geometrias correspondentes à sua aplicação de interesse no catálogo de misturadores microfluídicos1,2,3. Nos últimos anos, surgiu a ideia de usar esses dispositivos para produzir LNPs (nanopartículas lipídicas)4,5. As LNPs emergiram como o padrão ouro para a entrega de ácido nucleico6. São nanopartículas complexas, de 50 a 100 nm de diâmetro, compostas principalmente por lipídios ionizáveis catiônicos que podem se segregar dos outros componentes lipídicos quando suas cargas são neutralizadas, levando à formação de gotículas de óleo amorfo no núcleo das LNPs, conforme descrito em um estudo recente7,8. A molécula terapêutica no LNP depende da aplicação. Pode ser DNA, mRNA ou siRNA. As entidades funcionais aprisionadas ou adsorvidas na interface incluem porções PEG (geralmente ligadas a uma cadeia lipídica), lipídios auxiliares e colesterol. As nanopartículas lipídicas oferecem muitas vantagens em relação aos sistemas anteriores de distribuição de ácidos nucleicos baseados em lipídios: alta eficiência de encapsulamento de ácido nucleico, transfecção mais potente, penetração melhorada nos tecidos e baixa citotoxicidade e imunogenicidade. Essas características tornam as nanopartículas lipídicas excelentes candidatas para a entrega de ácidos nucleicos, como foi demonstrado pelas vacinas baseadas em mRNA contra COVID.

Os LNPs são formados por meio de um processo de automontagem. Simulações numéricas sugerem que o processo de automontagem inclui três etapas: montagem de partículas em aglomerados discoidais, agregação de aglomerados em fragmentos de membrana maiores e formação de vesículas9. A automontagem por difusão seria muito lenta (levaria dias), então a mistura hidrodinâmica é necessária. O uso de misturadores padrão5 em grandes recipientes é uma opção. No entanto, esses misturadores geram polidispersão de tamanho juntamente com baixa eficiência de encapsulamento. Portanto, etapas de pós-processamento, como filtração, extrusão e centrifugação, são necessárias para melhorar a qualidade das LNPs produzidas dessa maneira. Neste contexto, o uso de misturadores microfluídicos é relevante. Foi recentemente demonstrado que a microfluídica permite a produção de LNPs de qualidade aceitável em termos de monodispersão e rendimento de encapsulamento em uma única etapa com altos rendimentos. Em Fujishima et al.10 e Shepherd et al.11, um micromisturador espinha de peixe escalonado12 foi usado. Uma limitação dos micromisturadores espinha de peixe é seu baixo rendimento. Essa limitação pode ser contornada paralelizando o sistema11. No entanto, esta opção gera complexidade, aumenta o custo e reduz a confiabilidade. Os micromisturadores inerciais que operam com taxas de fluxo significativamente mais altas e, portanto, com rendimentos mais altos oferecem uma solução, mas até agora, embora algumas indicações possam ser encontradas na literatura, as condições sob as quais eles devem ser operados para obter LNPs funcionais ainda não foram totalmente elucidadas.

4 ml/min: Highly mixed regime with homogeneity factors above 80% and flat, reproducible concentration profiles. The Reynolds number range lies between 220 and the maximum value reached in the experiment, i.e., 1100./p> 4 ml/min at 7% (see Fig. 8B). In parallel, the EE was approximately 60% below 2 ml/mn, while particles formed at higher Q, above 4 ml/min, had an EE of approximately 80% (see Fig. 8C). These results were consistent with the results of the mixing study we performed. We have plotted, on the same graph, the boundaries of the three zones we singled out in Fig. 7 i.e., the poorly mixed, transition and highly mixed regions. Notably, the characteristics of the LNP structure correlate well with the mixing characteristics of the device. In addition, the ζ potential, indicating the effective surface charge29, was also measured. Regardless of the flow rate used, all LNPs exhibited a zeta potential of ζ = − 13 mV + /− 4 mV at pH 7.4 and were thus slightly negative. The measurement was consistent with Ref25 and suggested a loss of the positive charge of the ionizable lipid./p> 4 mL/min. At high FRR, \(\varepsilon_{m}\) is close to that of water, and the LNPs have optimal properties, while at small FRR, \(\varepsilon_{m}\) is substantially smaller, the energy landscape ‘seen’ by the LNP constituents is changed, and we may hypothesize that this affects the self-assembling process and thereby LNP morphologies in a detrimental manner. This type of situation occurs when important quantities of ethanol are used in the formulation24,30,31,32. From Fig. 9C, we estimate that the crossover between the nonoptimal and optimal cases is located around an effective relative dielectric constant \(\varepsilon_{m}\) close to 60, still for Q = 4 ml/min, which corresponds to a flow-rate ratio (FRR) on the order of 2./p>

blog